食品微生物微生物培養(yǎng)基制作技術實訓

1. 實驗器材

天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、錐形瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管桶、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿桶、玻璃棒、燒杯、試管架、剪刀、棉花、線繩、牛皮紙或報紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。

2. 實驗試劑

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、瓊脂、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、馬鈴薯、豆芽汁、磷酸銨、K2HPO4、NaNO3、KCL、MgSO4、FeSO4、1 mol/L NaOH溶液、 1 mol/L HCL溶液等。

3. 實驗流程

選擇原料→計算→稱重→混合溶解→調整pH→（加指示劑）→溶化瓊脂→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→鑒定→保存。

4. 實驗步驟

1) 原料的選擇、計算與稱量：根據培養(yǎng)基的配方，計算所配培養(yǎng)基需要原料的準確數量，選擇不同精密的稱量工具進行原料的稱取，常見的稱量工具有托盤天平、電子天平、分析天平等。 一般情況下，原料的稱量不需要很高精密度的儀器，用電子天平就可以了。

2) 混合溶解：將稱量好的各種原料根據要求將先后放入燒杯或其它容器中進行混合溶解，注意先加少于總量的水，在電爐上加熱溶解，溶解時需不斷攪拌。固體培養(yǎng)基需要最后加入瓊脂，邊加邊攪拌，待完全溶解后，補足所失水分。

3) 調整pH 值：用pH 試紙或 pH 計測定培養(yǎng)基 的pH，常用1moL/L NaOH溶液 或 1 moL/L HCL溶液調節(jié)培養(yǎng)基的 pH 到所需范圍。注意等培養(yǎng)基稍降低一些溫度后進行調節(jié)培養(yǎng)基pH值；在調節(jié)pH時，要逐滴加入酸堿調節(jié)劑，并隨時測定，以免調過再回調，否則會增加培養(yǎng)基中的鈉、氯等離子的含量。

4) 加指示劑：對某些培養(yǎng)基，按要求加入一定量指示劑。這時也需要注意培養(yǎng)基溫度不要太高。也可以將指示劑單獨滅菌，在用前，按需要比例加入溶解后的培養(yǎng)基，搖勻備用。

5) 溶化瓊脂：固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全熔化后才能停止攪拌，并補足水分（水需預熱）。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

6) 過濾：培養(yǎng)基配制后一般都有沉渣或渾濁出現，需要過濾方可使用，可用濾紙或2～4層的紗布過濾。固體培養(yǎng)基最好趁熱用紗布過濾。

7) 分裝：將過濾后的培養(yǎng)基根據實驗需要分裝于不同容器內，注意各容器的分裝量要求。三角燒瓶：不超過容量的1/2 ，高度的1/3 。試管：液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基約裝試管容量的1/4 ～ 1/3 ；斜面培養(yǎng)基約裝試管容量的1/5 。

8) 加塞：由紗布包棉花做成的棉塞（形如未打開傘之幼嫩蘑菇，大小和松緊適中）和現在的硅膠塞。因為硅膠塞一般不透氣，在滅菌的升溫和降溫過程中，試管內外壓力會有差異，當管內壓力大于管外壓力時可能使塞子飛出或試管爆裂。為了之后的滅菌過程順利，我們一般選用棉花塞。棉花塞透氣，能保持內外壓平衡，同時又能阻止細菌進入。棉花塞制作方法參見圖3-1。

①棉塞制作方法一

②棉塞制作方法二

圖3-1 棉塞制作方法（兩種方法）

培養(yǎng)基分裝后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，如培養(yǎng)基在短期內使用，也可在試管口套上試管帽。棉塞的作用有：一是阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內，防止引起培養(yǎng)基的污染。二是保證培養(yǎng)時有良好的通氣性能，因此棉塞的好壞對實驗的結果將有所影響。棉塞一般不宜用脫脂棉做，因為它易吸水變濕，容易造成污染，加塞時，棉塞總長的 2/3 在口內，1/3 在口外。

9) 包扎標記：加好塞后，在棉塞外再包上一層牛皮紙，以防滅菌時冷凝水直接沾濕棉塞及存放中防止塵埃等污染。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應先將試管成捆扎牢，上面包一層牛皮紙再扎緊，然后貼上標簽，標明培養(yǎng)基名稱、日期及組號后進行滅菌。

10) 滅菌：最常用的是高壓蒸汽滅菌法，將待滅菌的培養(yǎng)基放入加壓滅菌鍋內，培養(yǎng)基滅菌時的溫度和滅菌時間，按照不同種類的培養(yǎng)基的規(guī)定進行操作。以保證滅菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。

一般培養(yǎng)基配制說明上推薦的滅菌時間，是假定所滅菌的培養(yǎng)基的體積為1L或1L以下。如果需滅菌培養(yǎng)基的體積增加，時間延長，溫度不變。含有碳水化合物的培養(yǎng)基在高壓蒸汽滅菌時，溫度不能超過116℃～l18℃，防止出現碳水化合物的碳化水解。需要注意過度滅菌的培養(yǎng)基可能出現以下問題：培養(yǎng)基碳化或變黑；出現非典型的沉淀；降低瓊脂的凝結能力；改變正確的pH；失去營養(yǎng)價值；失去選擇性或鑒別性的能力。

高壓蒸汽滅菌鍋操作步驟如下：①加水：先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜注意水量一定要加足，否則容易造成事故。

②裝料：放回內層滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而打濕棉塞。

③加蓋密封：將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，切勿漏氣，否則達不到徹底滅菌的目的。

④排氣升壓：接通電源進行加熱，并同時打開排氣闕，使水沸騰以排出鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后(約1Omin)，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制電源，維持壓力至所需時間。

⑤降壓：達到規(guī)定的滅菌時間后，切斷電源，讓其自然降壓冷卻。

⑥取料：待壓力完全降至“0”時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品。如果壓力未降到“0”時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養(yǎng)基由于內外壓力不平衡而沖出瓶口或試管，造成棉塞沾污培養(yǎng)基而易發(fā)生污染。

⑦倒水：滅菌鍋使用過后，需將鍋內剩余的水倒掉，使鍋內保持干燥，以免日久腐蝕，并做好各項安全檢查后方能離開。

將上述培養(yǎng)基以0.105MPa，20min高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌則應放入冰箱內保存，但切記時間不宜過久。

拿出培養(yǎng)基后，按實驗需要進行制作斜面、平板等。若需制成斜面，則試管應傾斜放置，冷卻后即制成（參見圖3-2）；做穿刺用的固體或半固體培養(yǎng)基，試管應直立放置；制作成平板的，每個培養(yǎng)皿倒入15～20mL ，倒入后可以在平整的實驗臺面上順時針或逆時針搖勻，搖勻時注意不要將里面的培養(yǎng)基濺出（參見圖3-3）。

圖 3-2 斜面培養(yǎng)基的制作 

圖3-3 將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內

11) 鑒定：將消毒冷卻后的培養(yǎng)基置于 37 ℃恒溫箱內 培養(yǎng)24-48h后觀察有無雜菌生長，如無雜菌生長則可接入微生物菌種，經培養(yǎng)后觀察微生物生長發(fā)育情況，以便確定培養(yǎng)基是否合于實驗要求。

12) 保存：經驗定合格的培養(yǎng)基，可存放于冰箱（4 ℃左右）內或暗涼處清潔的柜內，避免干燥、氧化、pH 值的改變和雜菌的污染，這樣保存數星期仍然可用。但不宜保存時間過久，以少量勤做為宜。

5. 注意事項

（1）稱藥品用的各種藥匙不要混用；稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋，瓶蓋切莫張冠李戴，尤其是易吸潮的蛋白胨等更應注意及時蓋緊瓶塞與旋緊瓶蓋。

（2）調pH時要小心操作，盡量避免回調而帶入過多的無機離子。

（3）配制半固體或固體培養(yǎng)基時，瓊脂的用量應根據市售瓊脂的牌號而定，否則培養(yǎng)基的軟硬程度也會影響某些實驗結果。